新西蘭兔髂骨元素濃度和血清生化參量的測定

新西蘭兔髂骨元素濃度和血清生化參量的測定

張元勛　李德義　庄圭蓀
（中國科學院上海原子核研究所，上海 201800 ）

王智興　夏筠
（上海第二醫科大學附屬瑞金醫院，上海市傷骨科研究所，上海 200025 ）

摘　要　

本項工作培育家兔造成骨質疏鬆模型，用於研究婦女骨質疏鬆患者骨中無機元素的變化機理。使用中子活化分析技術測定三十例家兔髂骨中無機元素含量，結果表明實驗組中 F元素含量較對照組顯著增高（ P<0.001 ），鎂元素含量顯著減少（ P<0.001 ），而其它元素 K 、 Na 、 Ca 、 Ba 、 Mn 、 Sr 在兩組之間無顯著差異，結合家兔血清生化指標的測定，探討了元素對維持正常骨結構的意義。

關鍵詞　

骨質疏鬆，無機元素，中子活化分析

　　人體骨骼是由有機物、無機物和水三種成分組成的，無機物除了鈣、磷、納和鉀等常量元素外，還包括鎂、錳、鐵、鉻、鎳、銅、鋅、硒和鍶等人體必需的微量元素，有些毒性元素例如鉛也會蓄積在骨內，這些離子封閉在骨骼內，還可與其它離子結合在一起，可見微量元素與骨的結構關係密切 ^[1]。

　　近年來，我國老年人口以每年 3%的速度迅速增加，預計到 2000 年，六十歲以上老人將突破 4 億。老年人的骨質疏鬆症已成為常見病，婦女絕經後患此病尤多。骨質疏鬆症主要是骨礦含量減少，使骨折發生的危險明顯升高，嚴重威脅著老年人的生活質量和壽命。為了深入研究骨質疏鬆患者骨中無機元素變化機理，本項研究採用家兔造成骨質疏鬆模型後，使用中子活化分析技術測定疏鬆組和正常組家兔髂骨中的宏量和微量元素，觀察元素變化與骨質疏鬆之間相互關係，探討元素對維持正常骨結構的意義。結合血清中生化指標的測定，進一步了解老年骨質疏鬆患者骨內無機元素和生化參數的變化規律，為骨質疏鬆的預防和治療提供依據。

1.1　

樣本培養

　　實驗家兔是由上海松江縣松聯實驗動物場提供純新西蘭種成年雌性家兔三十只，飼養期為七個月，平均體重 3 Kg 。隨機分為兩組，其中 21 隻作為正常對照組，使用手術刀取得髂骨樣品，冷凍乾燥後備用。其餘 9 隻在無菌條件下手術摘除兩側卵巢，在普通級環境中繼續飼養八個月，通過骨密度測量確定已患骨質疏鬆症後，取得髂骨置於低溫下保存備用。

1.2　

樣品處理

　　實驗所用的器具包括坩堝、樣品盒、聚乙烯膜等都用 1:1 硝酸溶液浸泡 24 小時，然後用去離子水沖洗乾淨，在淨化室中自然晾乾備用。

　　首先將每份髂骨樣品精確稱重後，分別裝入坩堝，然後放入馬弗爐內加熱至 200℃ ，約 2 小時後再將溫度升高至 400℃ ，溫控 2 小時後骨樣炭化成灰褐色，冷卻後用玻璃捧將炭化物研成粉末狀。

　　每個樣本稱取炭粉約 100 mg ，裝入乾淨的聚乙烯小袋內封口後，置於中子活化跑兔裝置專用的聚乙烯小瓶內待用。

1.3　

實驗測定

　　實驗測定是使用上海分析測試中心微型反應堆中子活化分析裝置 ^[2] 。所有樣品在反應堆的 5x10¹¹n/cm²sec 熱中子通量下輻照 60 秒，然後根據所生成放射性核素衰變時間的長短分兩次使用 Ortec 公司 Ge（ Li ）探測器（對 ⁶⁰Co 分辨率為 2 Kev ）測定它們的放射活性，對鈣、氟、鎂、鈉等元素，輻照後馬上測定它們的放射活性，測量時間為 40 秒。對於鋇、錳、鍶、鉀等元素，輻照後等待 2-4 小時再測定它們的放射活性，測量時間為 600 秒。由探測器測得的活性轉換成電信號並耦合到一個多道（ 8129 道）脈沖幅度分析器和微機系統進行能譜解析和數據獲取。

　　使用配製的化標作相對定量，同時使用美國國家標準技術研究所（ NIST ）研製的骨粉標準參考物質 Bone Meal-1486 作為分析質控。

2.1　

骨樣本乾濕比

　　表 1 分別列出了兩組家兔髂骨的平均濕重、冷凍乾燥達到恆重後的乾重、高溫炭化後的粉末重量以及它們的相對比值。可以看出，正常組的乾 / 濕，炭化物 / 乾和炭化物 / 濕三項指標高於病變組 7% － 14% ，說明卵巢摘除後家兔髂骨礦物質含量呈明顯下降趨勢。

表１　骨樣乾濕比測定
Table 1　 The ratio of dry and wet in iliac crest samples

	對照組 (n=21) Control group	實驗組 (n=9) Experimental group
濕重 (g) 　 Wet weight	2.01 ± 0.29	2.51 ± 0.17
乾重 (g) 　 Dry weight	1.46 ± 0.22	1.71 ± 0.21
炭化物 (g) 　 Carbide weight	0.76 ± 0.16	0.82 ± 0.15
乾 / 濕　 Dry / Wet	0.73 ± 0.07	0.68 ± 0.07
炭化物 / 乾　 Carbide / Dry	0.52 ± 0.04	0.48 ± 0.05
炭化物 / 濕　 Carbide / Wet	0.38 ± 0.04	0.33 ± 0.05

2.2　

無機及微量元素濃度

　　表 2 列出家兔髂𣿅骨無機元素的中子活化分析結果。使用 T 檢驗統計方法比較對照組和實驗組的平均濃度差異，可以看出在實驗組中 F 元素含量明顯高於對照組， Mg 元素含量明顯低於對照組，它們之間有非常顯者差異（ P<0.001 ），而元素 Ca 、 Na 、 Ba 、 Mn 、 Sr 、 K 兩組之間無顯著差異。

表２　家兔髂骨無機元素的 NNA 測定結果 (μ g/g)
Table 2　 The results of inorganic elements in rabbit iliac crest by NAA

元素 Element	對照組 X+σ （例數） Control group (cases)	實驗組 X+σ （例數） Experimental group (cases)	T值	顯著性水平 P Significance
Ca	331790 ± 33500 (21)	341280 ± 22580 (9)	0.7735	---
F	991 ± 387 (21)	2075 ± 267 (9)	7.6118	<0.001
Mg	5274 ± 646 (21)	4438 ± 194 (9)	3.7720	<0.001
Na	7594 ± 815 (21)	8106 ± 545 (9)	1.8750	---
Ba	108 ± 59 (7)	111 ± 38 (2)	0.1508	---
Mn	1.026 ± 0.18 (21)	1.060 ± 0.16 (9)	0.4832	---
Sr	215 ± 49 (20)	205 ± 61 (9)	0.4782	---
K	1763 ± 500 (21)	2021 ± 610 (9)	1.4772	---

2.3　

生化指標測定

　　除測定無機和微量元素外，我們同時採集家兔卵巢摘除前和摘除後八個月的血清樣本，測定手術前後𠗟性磷酸𠕇、酸性磷酸𠕇和骨特異性磷酸𠕇指標。表 3 列出的測定結果表明，摘除卵巢 8 個月後的血清𠗟性磷酸𠕇、酸性磷酸𠕇和骨特異性𠗟性磷酸𠕇活性均低於手術前，差異均非常顯著（ P<0.001 ）。骨特異性𠗟性磷酸𠕇活性降低的幅度比𠗟性磷酸𠕇明顯 ^[3] 。

表３　新西蘭兔卵巢摘除前、後三種血清磷酸𠕇活性的變化 U/L
Table 3　 Three serum phosphatase activities in Newzealand rabbits before and after operation

	手術前 Before operation	手術後八個月 8 months after operation	下降比例 % Reduce rate	顯著性水平 P Significance
酸性磷酸 Acid phosphatase	19.06 ± 5.46	11.04 ± 4.10	42.08	<0.001
性磷酸 Alkaline Phosphatase	20.06 ± 8.20	14.60 ± 4.64	27.22	<0.001
骨特異性性磷酸 Bone Specific Alkaline Phosphatase	14.04 ± 1.67	4.44 ± 2.10	68.38	<0.001

　　骨中微量元素含量測定文獻報導甚少，這與骨樣製備和測定困難有關，常用原子吸收光譜法（ AAS ）和離子質譜儀（ SIMS ）測定，但它們不能作多元素同時分析，因此工作效率很低 ^[4] 。本工作採用中子活化分析技術彌補了這一不足。它能一次同時分析測定各種元素，快速、準確地得到分析結果，已成功地運用於微量分析領域。

　　骨質疏鬆通常是由於骨礦成分和骨基質等比例地減少，使骨的結構和功能發生變化而造成的疾病。近二十年的研究表明，鎂在骨質疏鬆症中的作用已引起人們的注意，人體內鎂總量的一半以上是在骨內，鎂的缺乏在骨質疏鬆形成中起了一個明顯的作用。 Freitay ^[5] 曾系統觀察 Mg 缺乏狗的骨形態學、生化及激素的變化，証實患有骨質疏鬆症的狗骨內 Mg 含量低於對照組，從骨定量分析，無論是以骨基質的百分數，還是以骨總面積覆蓋的類骨質的百分數來比較， Mg 缺乏組均顯著低於對照組。 John 等人 ^[6] 調查了老年性絕經後和葯物引起的骨質疏鬆症 60 例，發現紅細胞中鎂的水平下降，且與骨質疏鬆症的嚴重程度成正比。我們的結果與國內外的結論相一致，病變組骨 Mg 含量下降，引起骨礦含量減少。表明鎂作為骨的催化劑是控制骨基質形成的最重要因素之一，它的礦化作用在老年性和絕經後骨質疏鬆症的發病機理中起重要作用。

　　我們的結果顯示髂骨中氟含量實驗組明顯高於對照組，值得進一步深入探討。已有文獻表明 ^[7][8] ，骨氟是隨年齡的增長而逐漸積累。氟能影響骨細胞的生物功能以及骨晶體的生化性能，氟激活成骨細胞並增加鬆質骨量，然而它對骨折發病率的影響尚有爭議，也可能與劑量有關。有人做過一組雙盲對照研究，採用氟化鈉 75 mg/日，盡管脊椎骨量增加，但股骨骨折的實際發病率增加，椎體骨折的發病率無明顯變化。現代研究表明，氟化物能穩定礦物質結晶和刺激成骨細胞形成新的基質，但由於氟治療會增加骨的脆性和存在氟中毒的副作用，對其廣泛應用仍持有不同意見，提示氟治療和氟化物治療值得進一步研究。

　　微量元素在人體代謝和生化功能中起著極其重要的作用，主要是參與許多𠕇的合成和激活作用，鎂包含在 300 多種𠕇的功能中，完成體內各種代謝過程，它是能量轉運、儲存和利用的關鍵元素。鋅與體內 180 多種𠕇如𠗟性磷酸𠕇，乳酸脫氫𠕇的活性有關。 Mn 是精氨酸鋛𠕇， RNA 多聚𠕇等𠕇的重要組成成分。如果缺乏這些元素，將導致人體代謝紊亂。因此將骨中無機元素與生化指示器結合起來研究，對老年骨質疏鬆的發病機理、防治和治療研究有著很大意義。

參考文獻

1.	Ahlgren L, Mattsson S. Phys Med Biol, 1979; 24: 136
2.	Cheng Yuandi, Zhuang Guisheng, Wang Yinsong et al. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1988; 1:19
3.	王智興，夏筠，楊慶銘，上海實驗動物科學， 1996;16(2):79
4.	Zhang Yuanxun, Zhang Yongping, Tong Yongpeng et al. J. Radioanal. Nucl. Chem., 1996; 212:341
5.	Freitay J. J Clin Invest, 1979; 64: 1238
6.	John H, Beattie k, Avenell A. Nutrition Research Reviews, 1992; 5: 167
7.	Bratter P. Trace element analytical chemistry in medicine and biology, Volume 2, New York: New York Academic, 1983:555
8.	Yasuhivo Suzuki Tohoku J Exp Med, 1979; 129: 327