新 西 蘭 兔 髂 骨 元 素 濃 度 和 血 清 生 化 參 量 的 測 定

 

張 元 勛   李 德 義   庄 圭 蓀
( 中 國 科 學 院 上 海 原 子 核 研 究 所 , 上 海 201800 )

王 智 興   夏 筠
( 上 海 第 二 醫 科 大 學 附 屬 瑞 金 醫 院 , 上 海 市 傷 骨 科 研 究 所 , 上 海 200025 )

 

摘   要   本 項 工 作 培 育 家 兔 造 成 骨 質 疏 鬆 模 型 , 用 於 研 究 婦 女 骨 質 疏 鬆 患 者 骨 中 無 機 元 素 的 變 化 機 理 。 使 用 中 子 活 化 分 析 技 術 測 定 三 十 例 家 兔 髂 骨 中 無 機 元 素 含 量 , 結 果 表 明 實 驗 組 中 F元 素 含 量 較 對 照 組 顯 著 增 高 ( P<0.001 ) , 鎂 元 素 含 量 顯 著 減 少 ( P<0.001 ) , 而 其 它 元 素 K 、 Na 、 Ca 、 Ba 、 Mn 、 Sr 在 兩 組 之 間 無 顯 著 差 異 , 結 合 家 兔 血 清 生 化 指 標 的 測 定 , 探 討 了 元 素 對 維 持 正 常 骨 結 構 的 意 義 。
關 鍵 詞   骨 質 疏 鬆 , 無 機 元 素 , 中 子 活 化 分 析
 
 
    人 體 骨 骼 是 由 有 機 物 、 無 機 物 和 水 三 種 成 分 組 成 的 , 無 機 物 除 了 鈣 、 磷 、 納 和 鉀 等 常 量 元 素 外 , 還 包 括 鎂 、 錳 、 鐵 、 鉻 、 鎳 、 銅 、 鋅 、 硒 和 鍶 等 人 體 必 需 的 微 量 元 素 , 有 些 毒 性 元 素 例 如 鉛 也 會 蓄 積 在 骨 內 , 這 些 離 子 封 閉 在 骨 骼 內 , 還 可 與 其 它 離 子 結 合 在 一 起 , 可 見 微 量 元 素 與 骨 的 結 構 關 係 密 切 [1]
    近 年 來 , 我 國 老 年 人 口 以 每 年 3%的 速 度 迅 速 增 加 , 預 計 到 2000 年 , 六 十 歲 以 上 老 人 將 突 破 4 億 。 老 年 人 的 骨 質 疏 鬆 症 已 成 為 常 見 病 , 婦 女 絕 經 後 患 此 病 尤 多 。 骨 質 疏 鬆 症 主 要 是 骨 礦 含 量 減 少 , 使 骨 折 發 生 的 危 險 明 顯 升 高 , 嚴 重 威 脅 著 老 年 人 的 生 活 質 量 和 壽 命 。 為 了 深 入 研 究 骨 質 疏 鬆 患 者 骨 中 無 機 元 素 變 化 機 理 , 本 項 研 究 採 用 家 兔 造 成 骨 質 疏 鬆 模 型 後 , 使 用 中 子 活 化 分 析 技 術 測 定 疏 鬆 組 和 正 常 組 家 兔 髂 骨 中 的 宏 量 和 微 量 元 素 , 觀 察 元 素 變 化 與 骨 質 疏 鬆 之 間 相 互 關 係 , 探 討 元 素 對 維 持 正 常 骨 結 構 的 意 義 。 結 合 血 清 中 生 化 指 標 的 測 定 , 進 一 步 了 解 老 年 骨 質 疏 鬆 患 者 骨 內 無 機 元 素 和 生 化 參 數 的 變 化 規 律 , 為 骨 質 疏 鬆 的 預 防 和 治 療 提 供 依 據 。
 
 
 
1.1  樣 本 培 養
    實 驗 家 兔 是 由 上 海 松 江 縣 松 聯 實 驗 動 物 場 提 供 純 新 西 蘭 種 成 年 雌 性 家 兔 三 十 只 , 飼 養 期 為 七 個 月 , 平 均 體 重 3 Kg 。 隨 機 分 為 兩 組 , 其 中 21 隻 作 為 正 常 對 照 組 , 使 用 手 術 刀 取 得 髂 骨 樣 品 , 冷 凍 乾 燥 後 備 用 。 其 餘 9 隻 在 無 菌 條 件 下 手 術 摘 除 兩 側 卵 巢 , 在 普 通 級 環 境 中 繼 續 飼 養 八 個 月 , 通 過 骨 密 度 測 量 確 定 已 患 骨 質 疏 鬆 症 後 , 取 得 髂 骨 置 於 低 溫 下 保 存 備 用 。
 
1.2  樣 品 處 理
    實 驗 所 用 的 器 具 包 括 坩 堝 、 樣 品 盒 、 聚 乙 烯 膜 等 都 用 1:1 硝 酸 溶 液 浸 泡 24 小 時 , 然 後 用 去 離 子 水 沖 洗 乾 淨 , 在 淨 化 室 中 自 然 晾 乾 備 用 。
    首 先 將 每 份 髂 骨 樣 品 精 確 稱 重 後 , 分 別 裝 入 坩 堝 , 然 後 放 入 馬 弗 爐 內 加 熱 至 200℃ , 約 2 小 時 後 再 將 溫 度 升 高 至 400℃ , 溫 控 2 小 時 後 骨 樣 炭 化 成 灰 褐 色 , 冷 卻 後 用 玻 璃 捧 將 炭 化 物 研 成 粉 末 狀 。
    每 個 樣 本 稱 取 炭 粉 約 100 mg , 裝 入 乾 淨 的 聚 乙 烯 小 袋 內 封 口 後 , 置 於 中 子 活 化 跑 兔 裝 置 專 用 的 聚 乙 烯 小 瓶 內 待 用 。
 
1.3  實 驗 測 定
    實 驗 測 定 是 使 用 上 海 分 析 測 試 中 心 微 型 反 應 堆 中 子 活 化 分 析 裝 置 [2] 。 所 有 樣 品 在 反 應 堆 的 5x1011n/cm2sec 熱 中 子 通 量 下 輻 照 60 秒 , 然 後 根 據 所 生 成 放 射 性 核 素 衰 變 時 間 的 長 短 分 兩 次 使 用 Ortec 公 司 Ge( Li ) 探 測 器 ( 對 60Co 分 辨 率 為 2 Kev ) 測 定 它 們 的 放 射 活 性 , 對 鈣 、 氟 、 鎂 、 鈉 等 元 素 , 輻 照 後 馬 上 測 定 它 們 的 放 射 活 性 , 測 量 時 間 為 40 秒 。 對 於 鋇 、 錳 、 鍶 、 鉀 等 元 素 , 輻 照 後 等 待 2-4 小 時 再 測 定 它 們 的 放 射 活 性 , 測 量 時 間 為 600 秒 。 由 探 測 器 測 得 的 活 性 轉 換 成 電 信 號 並 耦 合 到 一 個 多 道 ( 8129 道 ) 脈 沖 幅 度 分 析 器 和 微 機 系 統 進 行 能 譜 解 析 和 數 據 獲 取 。
    使 用 配 製 的 化 標 作 相 對 定 量 , 同 時 使 用 美 國 國 家 標 準 技 術 研 究 所 ( NIST ) 研 製 的 骨 粉 標 準 參 考 物 質 Bone Meal-1486 作 為 分 析 質 控 。
 
 
 
2.1  骨 樣 本 乾 濕 比
 
    表 1 分 別 列 出 了 兩 組 家 兔 髂 骨 的 平 均 濕 重 、 冷 凍 乾 燥 達 到 恆 重 後 的 乾 重 、 高 溫 炭 化 後 的 粉 末 重 量 以 及 它 們 的 相 對 比 值 。 可 以 看 出 , 正 常 組 的 乾 / 濕 , 炭 化 物 / 乾 和 炭 化 物 / 濕 三 項 指 標 高 於 病 變 組 7% - 14% , 說 明 卵 巢 摘 除 後 家 兔 髂 骨 礦 物 質 含 量 呈 明 顯 下 降 趨 勢 。
 
表 1   骨 樣 乾 濕 比 測 定
Table 1  The ratio of dry and wet in iliac crest samples
 
對 照 組 (n=21)
Control group
實 驗 組 (n=9)
Experimental group
濕 重 (g)   Wet weight 2.01 ± 0.29 2.51 ± 0.17
乾 重 (g)   Dry weight 1.46 ± 0.22 1.71 ± 0.21
炭 化 物 (g)   Carbide weight 0.76 ± 0.16 0.82 ± 0.15
乾 / 濕   Dry / Wet 0.73 ± 0.07 0.68 ± 0.07
炭 化 物 / 乾   Carbide / Dry 0.52 ± 0.04 0.48 ± 0.05
炭 化 物 / 濕   Carbide / Wet 0.38 ± 0.04 0.33 ± 0.05
 
2.2  無 機 及 微 量 元 素 濃 度
 
    表 2 列 出 家 兔 髂 C 骨 無 機 元 素 的 中 子 活 化 分 析 結 果 。 使 用 T 檢 驗 統 計 方 法 比 較 對 照 組 和 實 驗 組 的 平 均 濃 度 差 異 , 可 以 看 出 在 實 驗 組 中 F 元 素 含 量 明 顯 高 於 對 照 組 , Mg 元 素 含 量 明 顯 低 於 對 照 組 , 它 們 之 間 有 非 常 顯 者 差 異 ( P<0.001 ) , 而 元 素 Ca 、 Na 、 Ba 、 Mn 、 Sr 、 K 兩 組 之 間 無 顯 著 差 異 。
 
表 2   家 兔 髂 骨 無 機 元 素 的 NNA 測 定 結 果 (μ g/g)
Table 2  The results of inorganic elements in rabbit iliac crest by NAA
 
元 素
Element
對 照 組 X+σ ( 例 數 )
Control group (cases)
實 驗 組 X+σ ( 例 數 )
Experimental group (cases)
T值 顯 著 性 水 平 P
Significance
Ca 331790 ± 33500 (21) 341280 ± 22580 (9) 0.7735 ---
F 991 ± 387 (21) 2075 ± 267 (9) 7.6118 <0.001
Mg 5274 ± 646 (21) 4438 ± 194 (9) 3.7720 <0.001
Na 7594 ± 815 (21) 8106 ± 545 (9) 1.8750 ---
Ba 108 ± 59 (7) 111 ± 38 (2) 0.1508 ---
Mn 1.026 ± 0.18 (21) 1.060 ± 0.16 (9) 0.4832 ---
Sr 215 ± 49 (20) 205 ± 61 (9) 0.4782 ---
K 1763 ± 500 (21) 2021 ± 610 (9) 1.4772 ---
 
2.3  生 化 指 標 測 定
 
    除 測 定 無 機 和 微 量 元 素 外 , 我 們 同 時 採 集 家 兔 卵 巢 摘 除 前 和 摘 除 後 八 個 月 的 血 清 樣 本 , 測 定 手 術 前 後 B 性 磷 酸 @ 、 酸 性 磷 酸 @ 和 骨 特 異 性 磷 酸 @ 指 標 。 表 3 列 出 的 測 定 結 果 表 明 , 摘 除 卵 巢 8 個 月 後 的 血 清 B 性 磷 酸 @ 、 酸 性 磷 酸 @ 和 骨 特 異 性 B 性 磷 酸 @ 活 性 均 低 於 手 術 前 , 差 異 均 非 常 顯 著 ( P<0.001 ) 。 骨 特 異 性 B 性 磷 酸 @ 活 性 降 低 的 幅 度 比 B 性 磷 酸 @ 明 顯 [3]
 
表 3   新 西 蘭 兔 卵 巢 摘 除 前 、 後 三 種 血 清 磷 酸 @ 活 性 的 變 化 U/L
Table 3  Three serum phosphatase activities in Newzealand rabbits before and after operation
 
手 術 前
Before operation
手 術 後 八 個 月
8 months after operation
下 降 比 例 %
Reduce rate
顯 著 性 水 平 P
Significance
酸 性 磷 酸
Acid phosphatase
19.06 ± 5.46 11.04 ± 4.10 42.08 <0.001
性 磷 酸
Alkaline Phosphatase
20.06 ± 8.20 14.60 ± 4.64 27.22 <0.001
骨 特 異 性 性 磷 酸
Bone Specific Alkaline Phosphatase
14.04 ± 1.67 4.44 ± 2.10 68.38 <0.001
 
 
 
    骨 中 微 量 元 素 含 量 測 定 文 獻 報 導 甚 少 , 這 與 骨 樣 製 備 和 測 定 困 難 有 關 , 常 用 原 子 吸 收 光 譜 法 ( AAS ) 和 離 子 質 譜 儀 ( SIMS ) 測 定 , 但 它 們 不 能 作 多 元 素 同 時 分 析 , 因 此 工 作 效 率 很 低 [4] 。 本 工 作 採 用 中 子 活 化 分 析 技 術 彌 補 了 這 一 不 足 。 它 能 一 次 同 時 分 析 測 定 各 種 元 素 , 快 速 、 準 確 地 得 到 分 析 結 果 , 已 成 功 地 運 用 於 微 量 分 析 領 域 。
    骨 質 疏 鬆 通 常 是 由 於 骨 礦 成 分 和 骨 基 質 等 比 例 地 減 少 , 使 骨 的 結 構 和 功 能 發 生 變 化 而 造 成 的 疾 病 。 近 二 十 年 的 研 究 表 明 , 鎂 在 骨 質 疏 鬆 症 中 的 作 用 已 引 起 人 們 的 注 意 , 人 體 內 鎂 總 量 的 一 半 以 上 是 在 骨 內 , 鎂 的 缺 乏 在 骨 質 疏 鬆 形 成 中 起 了 一 個 明 顯 的 作 用 。 Freitay [5] 曾 系 統 觀 察 Mg 缺 乏 狗 的 骨 形 態 學 、 生 化 及 激 素 的 變 化 , 証 實 患 有 骨 質 疏 鬆 症 的 狗 骨 內 Mg 含 量 低 於 對 照 組 , 從 骨 定 量 分 析 , 無 論 是 以 骨 基 質 的 百 分 數 , 還 是 以 骨 總 面 積 覆 蓋 的 類 骨 質 的 百 分 數 來 比 較 , Mg 缺 乏 組 均 顯 著 低 於 對 照 組 。 John 等 人 [6] 調 查 了 老 年 性 絕 經 後 和 葯 物 引 起 的 骨 質 疏 鬆 症 60 例 , 發 現 紅 細 胞 中 鎂 的 水 平 下 降 , 且 與 骨 質 疏 鬆 症 的 嚴 重 程 度 成 正 比 。 我 們 的 結 果 與 國 內 外 的 結 論 相 一 致 , 病 變 組 骨 Mg 含 量 下 降 , 引 起 骨 礦 含 量 減 少 。 表 明 鎂 作 為 骨 的 催 化 劑 是 控 制 骨 基 質 形 成 的 最 重 要 因 素 之 一 , 它 的 礦 化 作 用 在 老 年 性 和 絕 經 後 骨 質 疏 鬆 症 的 發 病 機 理 中 起 重 要 作 用 。
    我 們 的 結 果 顯 示 髂 骨 中 氟 含 量 實 驗 組 明 顯 高 於 對 照 組 , 值 得 進 一 步 深 入 探 討 。 已 有 文 獻 表 明 [7][8] , 骨 氟 是 隨 年 齡 的 增 長 而 逐 漸 積 累 。 氟 能 影 響 骨 細 胞 的 生 物 功 能 以 及 骨 晶 體 的 生 化 性 能 , 氟 激 活 成 骨 細 胞 並 增 加 鬆 質 骨 量 , 然 而 它 對 骨 折 發 病 率 的 影 響 尚 有 爭 議 , 也 可 能 與 劑 量 有 關 。 有 人 做 過 一 組 雙 盲 對 照 研 究 , 採 用 氟 化 鈉 75 mg/日 , 盡 管 脊 椎 骨 量 增 加 , 但 股 骨 骨 折 的 實 際 發 病 率 增 加 , 椎 體 骨 折 的 發 病 率 無 明 顯 變 化 。 現 代 研 究 表 明 , 氟 化 物 能 穩 定 礦 物 質 結 晶 和 刺 激 成 骨 細 胞 形 成 新 的 基 質 , 但 由 於 氟 治 療 會 增 加 骨 的 脆 性 和 存 在 氟 中 毒 的 副 作 用 , 對 其 廣 泛 應 用 仍 持 有 不 同 意 見 , 提 示 氟 治 療 和 氟 化 物 治 療 值 得 進 一 步 研 究 。
    微 量 元 素 在 人 體 代 謝 和 生 化 功 能 中 起 著 極 其 重 要 的 作 用 , 主 要 是 參 與 許 多 @ 的 合 成 和 激 活 作 用 , 鎂 包 含 在 300 多 種 @ 的 功 能 中 , 完 成 體 內 各 種 代 謝 過 程 , 它 是 能 量 轉 運 、 儲 存 和 利 用 的 關 鍵 元 素 。 鋅 與 體 內 180 多 種 @ 如 B 性 磷 酸 @ , 乳 酸 脫 氫 @ 的 活 性 有 關 。 Mn 是 精 氨 酸 A @ , RNA 多 聚 @ 等 @ 的 重 要 組 成 成 分 。 如 果 缺 乏 這 些 元 素 , 將 導 致 人 體 代 謝 紊 亂 。 因 此 將 骨 中 無 機 元 素 與 生 化 指 示 器 結 合 起 來 研 究 , 對 老 年 骨 質 疏 鬆 的 發 病 機 理 、 防 治 和 治 療 研 究 有 著 很 大 意 義 。
 
 
參 考 文 獻
 
1.  Ahlgren L, Mattsson S. Phys Med Biol, 1979; 24: 136
2.  Cheng Yuandi, Zhuang Guisheng, Wang Yinsong et al. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1988; 1:19
3.  王 智 興 , 夏 筠 , 楊 慶 銘 , 上 海 實 驗 動 物 科 學 , 1996;16(2):79
4.  Zhang Yuanxun, Zhang Yongping, Tong Yongpeng et al. J. Radioanal. Nucl. Chem., 1996; 212:341
5.  Freitay J. J Clin Invest, 1979; 64: 1238
6.  John H, Beattie k, Avenell A. Nutrition Research Reviews, 1992; 5: 167
7.  Bratter P. Trace element analytical chemistry in medicine and biology, Volume 2, New York: New York Academic, 1983:555
8.  Yasuhivo Suzuki Tohoku J Exp Med, 1979; 129: 327